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标题: 细胞活性测定方法有哪些？ [打印本页]

作者: doneast 时间: 2012-7-21 23:34
标题: 细胞活性测定方法有哪些？
材料与方法：
1、其细胞接种与MTT相同。
2、SRB用1%醋酸配成0.4%溶液。细胞在加药培养结束后用三氯醋酸（TCA）固定：贴壁细胞每个小孔加预冷的50%TCA液50ul（终浓度为10%）固定；悬浮细胞每孔加预冷的80%TCA50ul固定，加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置5分钟后再将平板移至4度放置1小时，这样可使悬浮细胞固定在培养孔的底部。
3、倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。
4、每孔加如100ulSRB液，在室温放置10分钟。细胞活性未与蛋白结合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空气干燥。
5、结合的SRB用150ul 10mmol/l非缓冲Tris碱液（ph10.5）溶解。
6、用自动化分光光度平板读数计在515nm波长处测定每个小孔的OD值。

本法用TCA固定细胞后，可随时用SRB作蛋白含量测定，不受测定时间的影响。SRB用tris溶解后也可稳定一个较长的时期。 TBE聚丙烯酰胺凝胶(电泳) OD与SRB浓度作图时，在OD 单位1.5-2.0间为线性，当超出线形范围时，必须稀释后重新读数。

MTT操作过程中必须吸出细胞培养的上清液，使之比较费时及增加可能的误差，大量使用DMSO也不受欢迎。此外，OD值随时间变化也是一个较大的缺点。当然SRB法操作比MTT复杂一点，但是时间可以自己掌握，不受测试时间的限制。

网友[CindyGloria]：

Trypan Blue 台盼蓝排斥试验，比较适合原代培养的细胞。

原理：
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。还有其他燃料，如伊红Y和苯胺黑等。

用品：
1. 4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。
2. 吸管、血细胞计数板、显微镜

步骤：
1、制备单细胞悬液。并作适当稀释（10 *6 细胞/ml）
2、染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。
3、计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞

结果：
镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。
根据下式求细胞活力：
活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100

注意事项：台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时，细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色，在显微镜下观察即可，活细胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。

网友[lalala_2004]：

台盼兰染色法价格低廉，操作简单，又不用无菌操作，做这个实验只要是把显微镜调好了，细胞浓度调好了就不会有问题，是一个养细胞的入门实验，所以很适合初学者做。我做这个实验主要是用来确定抑制细胞增殖的药物浓度，排除浓度过大引起的毒性反应。

MTT性价比最高，操作上也不复杂但是也要注意一些地方：
1、刚开始做MTT 实验的时候，结果的稳定性及重复性不好，后来查资料发现，MTT实验的最后OD值要控制在0.75－－1.25之间，这样才能保证数据有线性关系。在先控制好了合适的培养时间和细胞数后，所得到的数据还是令人满意的。
2、一定要保证每孔细胞数相同，这一点很重要，所以一定要充分混匀，边加边吹打，尽快加完。
3、尽量用新的96孔板，同时加样时注意准确，吸弃上清时，尽量小心，不要吸起沉淀，以减小误差。
4、血清浓度对MTT实验也有影响，尽量不高于5％，因为如果蛋白质含量高了，加入MTT反应后会有蛋白沉淀出现，最后的沉淀很难溶。
5、MTT试剂一定要注意避光，如果变绿了，就绝不能用了。

网友[细雨纷飞]：

改良MTT法在细胞活性测定中的应用：
原来的MTT法操作起来比较烦琐，要求技术熟练，但是结果的重复性比较差，因此我们在细胞增殖试验中采用了改良的MTT法，具体步骤如下：
1、细胞接种（96孔板），每孔100μl，细胞量2～5×104个（细胞数量将决定加入裂解液之后的孵育时间）。
2、根据聚体要求进行处理，处理物的量一般为10μl。
3、处理完之后直接加入10μlMTT，继续培养4小时。
4、直接加入裂解液100μl，裂解的时间由接种的细胞量决定，2～5×104个细胞，4小时可充分裂解，如果细胞数目比较大，就要延长孵育的时间。
（裂解液的配比：100ml的N,N-二甲基甲酰胺，100ml蒸馏水，30gSDS（十二烷基硫酸钠）；搅拌待SDS充分溶解之后过滤，过滤得到的液体即可直接应用）
5、裂解完毕之后在振荡器上振荡10min，酶标仪测定。

本方法的方便之处是不要反复吸出液体，减少了操作不当影响结果，每次操作只要直接加入液体就可以了，但是加入的量要按上述说过的量，要不就会溢出孔外，重点是裂解液的配比。

作者: 花开留白 时间: 2012-7-24 11:14
好熟悉的感觉啊

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